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Flav蛋白和NDH-1復合物協(xié)同保護藍藻光合作用
日期:2020-02-04 02:54:02

作者:Lauri Nikkanen, Anita Santana Sánchez, Maria Ermakova, Matthias R?gner, Laurent Cournac, Yagut Allahverdiyeva

時間:2020年1月9日

雜志:BioRxiv生物學預(yù)印本

標題:Functional redundancy and crosstalk between flavodiiron proteins and NDH-1 in Synechocystis sp. PCC 6803


研究背景:

光合生物具有不同的調(diào)控機制來應(yīng)對環(huán)境條件快速變化,以保護光合機構(gòu)免于損傷。波動光強可能會導致光合電子傳遞鏈(PETC),特別是光系統(tǒng)(PSI)的過度還原,從而給光系統(tǒng)帶來損傷風險。為了解決這個問題,藍細菌、藻類和植物(不包括被子植物)使用C型黃酮二鐵蛋白(FDP)作為強大的光保護電子庫,將多余的光合電子從PSI下游引導至O2。該過程稱為類似Mehler的反應(yīng),但與Mehler反應(yīng)相反,它不會產(chǎn)生有害的活性氧(ROS)。


β-藍藻(集胞藻屬PCC 6803,下文簡稱集胞藻)的基因組,編碼四種FDP亞型,即Flv1-4,它們以Flv1和Flv3或Flv2和Flv4組成的雜合低聚物在O2光還原中起主要的作用。本文作者之前的研究表明,在空氣CO2水平下,F(xiàn)lv1/3和Flv2/4雜聚物以協(xié)調(diào)和相互依賴的方式起作用:Flv1/3在照光開始時或在光強變強時刺激強烈的但短暫的O2光還原。Flv2/4雜聚物催化O2的穩(wěn)態(tài)還原,速率緩慢且催化能力弱,但也可以消耗PSI下游的電子。在堿性條件下(pH為9)的高濃度CO2和空氣CO2濃度中,編碼Flv2,F(xiàn)lv4和Sll0218蛋白的flv4-flv2操縱子被下調(diào)。盡管如此,在高濃度的CO2中,F(xiàn)lv1/3的低水平會刺激強烈的穩(wěn)態(tài)O2光還原,而在pH為9的空氣CO2中,F(xiàn)lv1/3只負責強烈但短暫的O2光還原。體外實驗表明重組Flv1,F(xiàn)lv3和Flv4的同型寡聚體可以通過NADH和/或NADPH還原O2,但FNR和還原態(tài)Fd是否是FDP的可能供體,尚未被證明。此外,與體外實驗相反,單獨過表達Flv1或Flv3的集胞藻突變體的研究清楚地表明, Flv3或Flv1的同型低聚物不參與體內(nèi)O2的光還原。因此,體內(nèi)FDPs的電子供體仍有待闡明。


在藍藻中,光合作用和呼吸電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)共存于類囊體膜上,并且相互錯綜復雜地聯(lián)系在一起,需要進行嚴格的調(diào)控。NAD(P)H脫氫酶復合物1(NDH-1,光合復合物I)主要分布于類囊體膜中,參與多種生物能量反應(yīng),包括PSI周圍的循環(huán)電子傳遞(CET),呼吸和通過碳濃縮機制(CCM)獲得CO2。NDH-1復合物以幾種形式存在,具有不同的生理作用:NDH-11型以NDHD1和NDHF1亞基為特征,并作為呼吸電子傳遞鏈的復合物I發(fā)揮功能;NDH-12則為NdhD2亞基,目前尚不清楚NDH-11和NDH-12是否具有不同的生理功能。NDH-13和NDH-14形式分別包括低Ci誘導的高親和力CO2獲取亞基NdhD3、NdhF3、CuPA和CUPS,或分別構(gòu)成的低親和力CO2獲取亞基NdhD4、NdhF4和CuPB,在CO2到HCO3-(O)的轉(zhuǎn)化中起作用。這一過程可能是由NDH-1質(zhì)子泵在類囊體膜上產(chǎn)生堿性口袋實現(xiàn)的。所有四種NDH-1類型都催化CET從鐵氧還蛋白(FD)到質(zhì)體醌(PQ),這與4H+/2e-泵入類囊體腔有關(guān)。然而,對于NDH-13,4,功能要弱于NDH-11,2


在本研究中,我們旨在闡明FDPS和NDH-1介導的電子傳遞通路如何在可變光照和Ci-濃度變化下,在Calvin-Benson-Bassham循環(huán)(CBB)中協(xié)同維持PETC、呼吸、CCM和CO2固定之間的氧化還原平衡。為此,我們采用生物物理和生物化學方法對同時存在FDP和NDH-1途徑缺陷的集胞藻突變株進行了研究。我們的結(jié)果為Flv1/3或NDH-11,2的存在提供了令人信服的證據(jù),但不是NDH-13,4,需要說明的是NDH-13,4對于集胞藻在從高濃度CO2條件過渡到空氣CO2和強光的聯(lián)合脅迫條件下的生存是必不可少的。我們證明Flv1/3和NDH-11,2的動態(tài)協(xié)調(diào)和協(xié)同作用是集胞藻細胞光合結(jié)構(gòu)光保護所必需的,并討論了其中涉及的分子機制。


實驗設(shè)計:

使用了耐葡萄糖的野生Synechocystis sp PCC 6803,單突變株Δflv1和Δflv3, M55突變株(ΔndhB), 雙突變體Δd1d2和Δd3d4和三突變體Δflv1d1d2, Δflv3d1d2, Δflv1d3d4和Δflv3d3d4。所有突變體均顯示出完全分離。實驗前的培養(yǎng)物以30ml分批培養(yǎng)在pH 7.5的BG-11培養(yǎng)基中,其他培養(yǎng)條件CO2為3%,溫度30℃,中等光強(ML)50 μmolm-2s-1連續(xù)白光。突變的預(yù)培養(yǎng)物補充有適當?shù)目股?。在對?shù)生長期,將細胞收獲并重懸于新鮮的不含抗生素的BG-11中,OD750為0.1–0.2。然后將細胞轉(zhuǎn)移到空氣[CO2] / 30℃,并用50或220μmolm-2s-1的白光連續(xù)照射。


測量參數(shù):

氣體交換,熒光和差示吸收(Y(ND), Y(NA), Y(I)),近紅外光譜吸收,77K熒光,NADPH,ECS, 蛋白質(zhì)提取及免疫印跡, 波動光響應(yīng)。


使用儀器:

DUAL-PAM-100,DUAL-KLAS-NIR,  9-AA/NADPH等


部分實驗結(jié)果:

通過對單個FDP突變體(Δflv1和Δflv3)和雙重NDH-1突變體(Δd1d2,其中NDH-11,2和Δd3d4缺乏,NDH-13,4),以及三重突變體(缺少Flv1或Flv3以及NDH-11,2或NDH-13,4之一)的研究表明,F(xiàn)lv1 / 3或NDH-11,2的存在對于生長條件從高CO2 /中等光照到低CO2 /高光照變化的生存是必不可少的。另外,在研究條件下,F(xiàn)DP和NDH-11,2之間存在功能冗余和串擾,并表明FDP和NDH-11,2的功能是動態(tài)協(xié)調(diào)的,以有效地氧化PSI,并在可變的CO2和波動光下進行光保護。

圖1200204.jpg

圖1 WT和突變體在不同實驗條件下的生長情況

所有的實驗培養(yǎng)都是從預(yù)培養(yǎng)開始,調(diào)整到OD750=0.1。(A)細胞在3%[CO2]/中等光照(ML 50μmolm-2s-1)中預(yù)培養(yǎng),調(diào)節(jié)OD750=0.1,在相同條件下生長。(B)細胞在3%[CO2]/中等光照下預(yù)培養(yǎng),然后轉(zhuǎn)移到空氣[CO2]/中等光照中。(C)細胞在空氣[CO2]/ML中預(yù)培養(yǎng),然后轉(zhuǎn)移到空氣[CO2]/高光照中(HL 220μmolm-2s-1)。(D)細胞在3%[CO2]/ 中等光照下預(yù)培養(yǎng),然后轉(zhuǎn)移到空氣[CO2]/ 高光照中。A-D中顯示的值是三個獨立的生物重復±SE的平均值。(E)WT細胞和突變細胞在含有BG-11的瓊脂平板上生長的結(jié)果。收集生長在3%[CO2]/ML下的細胞,以10倍梯度稀釋后點到BG-11瓊脂平板上,從OD750=1開始,分別在空氣[CO2]/ML和空氣[CO2]/HL下孵育7d。更多結(jié)果參考補充數(shù)據(jù)S1.

圖2200204.jpg

圖2 WT和突變體的O2和CO2交換率

細胞在空氣[CO2]/ML中培養(yǎng)4天后收獲細胞,用新鮮的BG-11調(diào)節(jié)Chla濃度至10μg·ml-1。暗適應(yīng)15min,用500μmolm-2s-1的白光照射5min,用膜進樣質(zhì)譜計監(jiān)測氣體交換情況。在測量之前,樣品添加了與16O2濃度相同的18O2,以區(qū)分O2的攝取和放氧,并添加了1.5 mM的NaHCO3。每組的虛線表示CO2固定的補償點(攝取速率等于呼吸速率)。實驗設(shè)置了三個獨立的生物重復,給出了具有代表性的測量結(jié)果。

圖3200204.jpg

圖3 WT和突變體在不同光強下的光合參數(shù)

(A) PSI的受體側(cè)限,Y(NA),(B)PSI的供體側(cè)限,Y(ND),以及(C)PSI的有效產(chǎn)率,Y(I)根據(jù)在875-830 nm處的差示吸收變化計算。葉綠素a熒光變化與PSI氧化還原變化同步測量,用于計算(D)PSII的有效產(chǎn)率。細胞在空氣中培養(yǎng)4d后收獲細胞,用新鮮BG-11調(diào)節(jié)Chla濃度至10μg ml-1。將細胞暗適應(yīng)10min,然后用紅色光化光強度在25和530μmolm-2s-1之間交替照射1min。每15秒提供飽和脈沖(Width: 500ms, Int.: 5000μmolm-2s-1)。所顯示的值是3-4個獨立生物重復±SE的平均值。

圖4200204.jpg

圖4 WT和突變體在波動光下的NADPH和Chl a熒光

WT(A)、Δflv3(B)、Δd1d2(C)和Δflv3 d1d2細胞(D)在空氣[CO2]/ML中培養(yǎng)4d后,收集細胞,用新鮮BG-11調(diào)節(jié)Chla濃度至5μg ml-1。暗適應(yīng)10min后,用25/530μmolm-2s-1的交替紅光照射1min。用Dual-PAM 100雙通道葉綠素熒光儀及其9-AA/NADPH附件模塊監(jiān)測NADPH氧化還原變化,方法是測量365 nm激發(fā)引起的420至580 nm之間的熒光變化。同時記錄葉綠素a熒光。(E)暗適應(yīng)細胞在530μmolm-2s-1照射過程中,NADPH氧化還原發(fā)生變化。其他實驗細節(jié)如A-D所示。(F)顯示(E)中照明的前2秒的放大結(jié)果。這些值分別根據(jù)在照明開始和停止時的最小和最大熒光變化來歸一化。用三個獨立的生物重復進行了實驗,其中顯示了具有代表性的測量結(jié)果。RU。=相對單位。

圖5200204.jpg

圖5 黑暗到HL轉(zhuǎn)變過程中PC、P700和FD的氧化還原變化,以及pmf的建立

將wt(A)、Δflv3(B)、Δd1d2(C)和Δflv3 d1d2(D)暗適應(yīng)10min,然后用DUAL-KLAS-NIR四通道近紅外光譜儀測量在503μmolm-2s-1紅光照射30s期間,在780-800 nm,820-870 nm,840-965 nm和870-965 nm處吸光度的差異變化。使用為本研究確定的差分模型曲線圖(DMPS)將PC、P700和Fd信號從吸光度差異變化中去卷積(圖S3)。A-D中的上圖顯示了下圖前1.5秒照光過程的放大結(jié)果。實驗設(shè)置了三個獨立的生物重復,其中顯示了具有代表性的測量結(jié)果。另請參閱補充圖S3。(E)從暗到500μmolm-2s-1的綠色光化光的過渡過程中pmf的積累。用JTS-10型光譜儀測量了500-480 nm(ECS)的吸光度差,根據(jù)ECS信號的暗間隔弛豫動力學(DIRK)測定了光誘導的pmf。給出了3-4個獨立實驗的平均值±SEM。小插圖顯示照明1s后的pmf值,以獲得更清晰的視圖。(F) 如(E),在光照1s和30s后的類囊體膜質(zhì)子導度(gH+)。gH+是通過ECS信號在第一次光照后衰減動力學時間常數(shù)的倒數(shù)來計算的。(G)類囊體質(zhì)子通量(vH+),以pmf×gH+計算。(H)500-480 nm吸光度差的代表性結(jié)果,用于測量E中的結(jié)果以及在光照30秒后的500 ms暗間隔期間ECS衰減動力學的值(下圖)。擬合曲線顯示為綠色。在空氣[CO2]/ML中生長4d后收獲細胞,用新鮮BG-11調(diào)節(jié)Chla濃度至10 μg ml-1(A-D),7.5μg ml-1(E-J)。

圖6200204.jpg

圖6 WT和突變體光合作用和CCM相關(guān)蛋白的免疫印跡檢測和77K熒光發(fā)射光譜

預(yù)培養(yǎng)在3%[CO2]/ML下培養(yǎng)3天,然后收獲,再懸浮在OD750=0.15新鮮的BG-11中,(A)在空氣[CO2]/ML中培養(yǎng)24小時,(B)在空氣[CO2]/ML中培養(yǎng)4天,收獲后再懸浮在OD750=0.15的BG-11中,然后在空氣[CO2]/ML中培養(yǎng)24小時。(C)在空氣[CO2]/HL中孵育24小時。用SDS-PAGE分離總蛋白提取物,并用特異性抗體進行檢測。所示的免疫印跡代表2-3個獨立的生物學重復。(D)完整的WT和ΔFlv3d1d2細胞在空氣[CO2]/ML中生長4天的77K熒光發(fā)射光譜。(E)在3%[CO2]/ML中預(yù)培養(yǎng)生長后收獲,再懸浮在OD750=0.15的新鮮BG-11中,在空氣[CO2]/HL中孵育24小時。將細胞(D和E)收獲,調(diào)節(jié)到Chla為7.5μg ml-1,在77K用440 nm光激發(fā)。將光譜歸一化為685 nm處的PSII熒光峰。

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圖7 協(xié)調(diào)FDPs和NDH-1的活性以防止PSI過度還原的模型示意圖

(A)在Fd庫大量還原而PQ庫沒有還原的條件下,NDH-1L將電子從Fd轉(zhuǎn)移到PQ池,同時通過類囊體局部RTOs還原O2。NDH-1L將2H+/e-泵入管腔,而FDP和RTO在類囊體液面將O2還原為H2O時消耗H+。這增加了跨類囊體pmf,而pmf反過來推動ATP合成,抑制Cytb6f處的PQH2氧化,從而防止進一步向PSI提供過多的電子。NDH1-MS的碳酸酐酶活性將HCO3-轉(zhuǎn)化為CO2,消耗胞質(zhì)中的H+,可能還耦合了H+到管腔的轉(zhuǎn)運,進一步增加了pmf。CO2利用率和ATP/NADPH比值的增加提高了CBB在PETC受體側(cè)的電子吸收能力。(B)如果PQ庫被高度還原,F(xiàn)d庫被氧化,并且pmf很高,則假設(shè)NDH-1L可以起相反的作用,通過從管腔釋放2H+/e-來將電子從PQH2轉(zhuǎn)移到Fd+。由Flv1/3催化的強Mehler式反應(yīng)在此時就非常有必要,以維持足夠的氧化態(tài)Fd庫,F(xiàn)lv1/3可能直接接受來自Fd-的電子。(A)中所述的大部分成分在(B)中被省略,以提高清晰度,而不是暗示它們不存在。PQ/PQH2和Fd的顏色填充范圍表示還原的水平。


由于相關(guān)研究內(nèi)容非常專業(yè),難免有些理解不準確或者編輯整理的疏漏,請以英文原文為準。


參考文獻

Nikkanen L E, Sanchez A I S, Ermakova M, et al. Functional redundancy and crosstalk between flavodiiron proteins and NDH-1 in Synechocystis sp. PCC 6803. bioRxiv, 2020: 2019.12. 23.886929.

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