有活力的花粉是植物成功繁育的基本要素之一，也是形成種子的先決條件。能夠長期保存有活力的花粉可為農(nóng)業(yè)、林業(yè)和園藝領(lǐng)域創(chuàng)造育種和生產(chǎn)的靈活性，并實(shí)現(xiàn)跨越地理和季節(jié)限制的有效雜交，從而減少在授粉過程中雌雄植株同步開花的協(xié)調(diào)工作并確保授粉花粉的可用性。茄科植物花粉冷凍保存是全世界雜交種子生產(chǎn)行業(yè)的普遍做法，集中進(jìn)行花粉生產(chǎn)對于確保知識產(chǎn)權(quán)、降低多年種子生產(chǎn)計(jì)劃中的雌雄比例以及花粉生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)管理等戰(zhàn)略來說具有特別重要的意義。
花粉冷凍保存通常包括脫水、冷卻、儲存、解凍和再水合這一系列過程，每個(gè)過程的出錯(cuò)會嚴(yán)重影響最終的花粉質(zhì)量，尤其是在工藝條件不理想的情況下，因此，監(jiān)測花粉供應(yīng)鏈上各個(gè)環(huán)節(jié)的花粉質(zhì)量是十分必要的。目前，育種者和種子生產(chǎn)商已將花粉活力檢測作為一種風(fēng)險(xiǎn)管理工具，以防止低質(zhì)量授粉而導(dǎo)致的產(chǎn)量損失。
傳統(tǒng)上進(jìn)行花粉活力的評估多以顯微鏡為基礎(chǔ)，如通過顯微鏡觀察花粉大小的變化、熒光或非熒光染料染色后花粉新陳代謝活動或膜的完整性、萌發(fā)率以及花粉管的生長情況，此類檢測中的數(shù)據(jù)分析通常通過人為量化細(xì)胞亞群或使用圖像處理軟件工具來完成。近些年，該領(lǐng)域逐漸引入了庫爾特計(jì)數(shù)器和阻抗流式細(xì)胞儀（IFC），如瑞士Amphasys公司的Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀就是專為分析花粉質(zhì)量而研發(fā)的設(shè)備，其原理是通過檢測流經(jīng)微流控芯片的單個(gè)花粉粒的電阻抗特性來區(qū)分花粉活力。對比勞動強(qiáng)度、分析和動手耗時(shí)、結(jié)果可靠性、標(biāo)準(zhǔn)化程度和測試成本等方面，所有這些技術(shù)都各有優(yōu)缺點(diǎn)。
本研究通過IFC活力法、體外萌發(fā)法以及花粉管長度分析，檢測了同一批冷凍保存下的番茄和辣椒花粉樣本，并對三種花粉質(zhì)量分析方法進(jìn)行了評估，以確定其是否適用于冷凍保存下的花粉的常規(guī)質(zhì)量控制。結(jié)果表明：
i. Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀（IFC活力法）得到的花粉活性可以解釋為花粉的發(fā)芽潛力，而體外萌發(fā)法則可在給定的發(fā)芽條件下直接量化花粉的發(fā)芽潛能，兩種分析方法之間存在線性相關(guān)；
ii. 對自動化程度、通量、可重復(fù)性和再現(xiàn)性要求高的應(yīng)用和行業(yè)來說，IFC活力法的理想的檢測工具；
iii. 由于難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，體外萌發(fā)法只適用于有一定時(shí)間和地域限制的研究；
iv. 由于通量低且可重復(fù)性差，通過花粉管長度分析花粉活性不能充分滿足行業(yè)需求。
IFC數(shù)據(jù)與顯微鏡鏡檢數(shù)據(jù)的相關(guān)性
表1 花粉粒的不同形態(tài)亞型
分類 | 描述 | 圖示 |
Aberrant 異常花粉 | 異常細(xì)胞與小孢子發(fā)育的中止有關(guān)，例如由于熱脅迫導(dǎo)致的敗育 |
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Aberrant 脫水花粉 | 這些花粉再水合并懸浮于萌發(fā)緩沖液中后，不能在形態(tài)上重建。可以清楚地看到類似 "咖啡豆 "的溝紋。 |
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Reconstituted, not germinated | 這類花粉粒通過再水合并懸浮在發(fā)芽緩沖液中，在形態(tài)上得以重組，但沒有形成花粉管，如圖1a–II |
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Reconstituted, pollen tube emerging | 這些花粉粒形成了花粉管，但花粉管的長度短于花粉的直徑 |
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Reconstituted, pollen tube longer than pollen diameter | 這些花粉粒形成了花粉管，但花粉管的長度短于花粉的直徑 |
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圖1 a. 顯微鏡下冷凍番茄花粉再水合過程中的形態(tài)重建（比例尺=50μm）：a-I)冷凍保存的番茄花粉，呈溝狀形態(tài)；a-II）在95-99%相對濕度下再水合30min后的番茄花粉，重建為更球形的形態(tài)；b. IFC火力法可量化不同類型的茄科花粉：圖上每個(gè)點(diǎn)對應(yīng)一粒花粉，通過分析可在相位-振幅散點(diǎn)圖中設(shè)置門控區(qū)分活化粉粒、死花粉粒和異?；ǚ哿＃籧 .番茄花粉類群的量化：百分比柱狀堆積圖：顯微鏡鏡檢法；散點(diǎn)圖：IFC活力法d. 辣椒和番茄花粉的樣品活性（IFC活力法）與形態(tài)可重建花粉占比（顯微鏡鏡檢）的相關(guān)性分析。
IFC活力法vs.體外萌發(fā)法vs.花粉管長度分析
圖2 IFC活力法、體外萌發(fā)法、花粉管長度分析三種花粉質(zhì)量評估的比較
荷蘭和瑞士兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的20個(gè)樣品的檢測結(jié)果表明，IFC活力法與體外萌發(fā)法之間有很強(qiáng)的正相關(guān)性（圖2a，番茄R2=0.77，辣椒R2=0.87）。其中，番茄和辣椒的體外萌發(fā)率分別比IFC活力平均低26%和19%。IFC活力和花粉管長度之間也存在正相關(guān)性，表明質(zhì)量較高的花粉批次往往含有更多活力更強(qiáng)的花粉，從而形成更長的花粉管（圖2b）。體外發(fā)芽率與花粉管長度間也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果（圖2c）。
不同測量方法的再現(xiàn)性和重復(fù)性
IFC法的再現(xiàn)性非常高，花粉活性平均偏差為5%（圖3a），可重復(fù)性強(qiáng)；體外萌發(fā)法再現(xiàn)率略低，平均偏差為9%，可重復(fù)性中等；花粉管進(jìn)行活力評估的結(jié)果差異較大，重復(fù)性較差。
圖3 不同試驗(yàn)方法的再現(xiàn)性和重復(fù)性
圖4 發(fā)芽培養(yǎng)基滲透壓對離體番茄花粉發(fā)芽率和花粉完整性的影響。高滲透壓緩沖液降低了發(fā)芽率和花粉破裂的風(fēng)險(xiǎn)（比例尺 = 100 μm）。
本次研究結(jié)果表明，體外萌發(fā)法和IFC活力法均適用于分析冷凍保存的番茄和辣椒花粉的活性，且二者間具有高度的線性相關(guān)性。但值得注意的是，體外萌發(fā)法需要測試者嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化測試方案，這包括緩沖液配方、測定溫度和萌發(fā)時(shí)間，并明確不同花粉形態(tài)和發(fā)芽水平分類標(biāo)準(zhǔn)，相較而言，其更適用于特定研究地點(diǎn)的短期實(shí)驗(yàn)；而IFC活力法是一種可在任意地點(diǎn)由任何用戶進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作的高通量檢測方法，更適用于涉及操作人員和實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)多、需要在更大時(shí)間窗口進(jìn)行數(shù)據(jù)對比的測試項(xiàng)目中。
—— 參考文獻(xiàn) ——
Langedijk, N.S.M., Kaufmann, S., Vos, E. et al. Evaluation of methods to assess the quality of cryopreserved Solanaceae pollen[J]. Sci Rep 13, 7344 (2023).
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