如今市面上有很多被稱為葉綠素熒光成像系統(tǒng)的設備。單就設備的型號來講，已經(jīng)不下十幾種，如，***PAM，***CAM，***Explorer，***View等等，進口的，國產(chǎn)的，封閉式的，開放式的，多功能的，多光譜的，高通量的，那叫一個眼花繚亂。如果這個時候廠家再給你一堆花花綠綠的圖片在您眼前不斷的閃現(xiàn)，請問您該如何和判斷這是什么？我要的是什么？好難！
葉綠素熒光成像系統(tǒng)是測量光合作用光反應能量轉(zhuǎn)換過程釋放的葉綠素熒光的成像工具。首先它是測量葉綠素熒光的，其次它可以成像。這下反而簡單了。
測量葉綠素熒光的方法有很多種，目前受歡迎和應用廣泛的是脈沖振幅調(diào)制(PAM)方法。下面的測量流程以脈沖振幅調(diào)制方法展開：在開始測量之前，葉片必須經(jīng)過幾分鐘或者幾十分鐘的暗適應，這取決于測量前葉子所處光環(huán)境的光強度和植物物種。黑暗中葉綠素a熒光的最小水平Fo通過低強度測量光（Measure Light, ML）獲得，而暗適應葉片的最大熒光產(chǎn)量Fm則用飽和光脈沖(Saturation Pulse, SP)進行評估。在光化光照明(Actinic Light, AL, 即施加的光強度）下，可以使用另一個飽和脈沖估計光適應狀態(tài)下的最大熒光Fm′。在施加的光化光AL關閉之前測量熒光的穩(wěn)態(tài)水平Fs。除此之外，在關閉AL后(有時需要開遠紅光Far Red Light, FR)，可以測到另一個葉綠素熒光的最低水平Fo′。Fm′和Fo′之間的差異是光下的最大可變熒光Fv′。根據(jù)這些測量的基本葉綠素熒光參數(shù)，可以計算出其他一些更常用于葉綠素熒光分析的參數(shù)。
葉綠素熒光測量解決了，下面該討論成像了。葉綠素熒光成像可沒那么簡單，因為它不單單是拍照。拍照是一門光學藝術，風景，人物拍照講究個構圖得當，光線協(xié)調(diào)，亮暗對比，但是這些都不適用于葉綠素熒光成像。葉綠素熒光成像該考慮哪些因素呢？
首先要考慮的是測量區(qū)域光場的均勻性。所謂的測量區(qū)域光場的均勻性是指在成像區(qū)域內(nèi)，各個不同位點的光強差異，差異越小，光場越均勻。光場內(nèi)的光強包括測量光，光化光，飽和脈沖光，遠紅光。是否均勻是衡量葉綠素熒光成像數(shù)據(jù)是否有效的基本原則。因為只有在光場均勻的情況下，才可以保證成像區(qū)域內(nèi)樣品上的每一點接受到的光強是一致的，才可以進行多葉片同時測量，才可以進行橫向異質(zhì)性分析。否則，數(shù)據(jù)的有效性無從談起。實踐證明，熒光成像系統(tǒng)并不是成像面積越大越好，首先要考慮的是成像均勻。如果光場不均勻，再大的成像面積也是無效面積，外圍和中心的測量結(jié)果也不具備可比性。
成像區(qū)域108個點的光強數(shù)據(jù)
其次要考慮的是工作距離。所謂的工作距離是指樣品和測量系統(tǒng)的光源以及成像的鏡頭的空間距離。工作距離和光場的均勻性是密切相關的，換句話說，光場在一個工作距離下是均勻的，換一個工作距離就不一定了。其次工作距離還影響樣品表面接收到的光強，距離越遠接收到的光強越弱。實際應用中，如果工作距離發(fā)生變化，請務必重新做光強校準。否則樣品實際接收的光強可能會與軟件顯示的光強不一致，不能正確反應樣品的實際生理狀態(tài)。
第三要考慮的是成像面積。所謂的成像面積是在設定的工作距離下測量區(qū)域光場均勻的有效面積。由此可見，成像面積和工作距離是密切相關的，光場均勻的區(qū)域才算有效面積，有效面積內(nèi)的所有位置被無差別測量，圖像內(nèi)的所有信息才有可比性。
第四個要考慮的是光源光強。光強包括測量光，光化光，飽和脈沖光的光強。1.測量光，它既不能太強，也不能太弱。測量光太弱，無法將本底熒光全部激發(fā)出來，導致飽和脈沖測量的可變熒光Fv包含部分Fo，F(xiàn)v被高估。測量光太強，會破壞暗適應的狀態(tài)，導致測量的Fv被低估。2.光化光，它是在葉綠素熒光測量過程中誘導植物發(fā)生光合作用的光，通常強度是可調(diào)的。如果使用葉綠素熒光成像系統(tǒng)測量光響應曲線的話，光化光的強度通常需要達到1500-2000 μmol m-2 s-1。3.飽和脈沖光，它是用來測量和計算數(shù)據(jù)的光，在飽和脈沖期間，光系統(tǒng)被全部關閉，此時可以根據(jù)熒光發(fā)射的多少計算光化學淬滅和非光化學淬滅以及電子傳遞。飽和脈沖光的強度通常需要在3000-5000 μmol m-2 s-1以上。
總結(jié)一下，目前的葉綠素熒光成像系統(tǒng)還是一個平面2D應用的測量系統(tǒng)。您也許會說，植物是立體的呀！是的，植物沒有錯，但是考慮到光源，成像鏡頭和樣品的空間距離是線性的。所以葉綠素熒光成像也是平面2D的，既然是平面測量系統(tǒng)，那么就要考慮成像區(qū)域的光場均勻性，就要時刻注意光源和鏡頭與葉片之間的距離，一個實驗中的所有樣品要以相同的距離進行測量。測量前準備階段的光強校準也要在這個距離下進行。最后，葉綠素熒光成像系統(tǒng)的光源配置要滿足葉綠素熒光測量的基本要求。
所以，我們想從專業(yè)服務的角度給各位老師和同學提兩點建議。1.如果您正在使用葉綠素熒光成像系統(tǒng)，請認真思考上面提到的四點，非常重要。2.如果您計劃采購葉綠素熒光成像系統(tǒng)，同樣需要關注上面提到的四點，非常重要！
除了上面提到的四點以外，葉綠素熒光成像系統(tǒng)還有一些其他的技術參數(shù)需要注意，比如CCD的幀率，鏡頭的焦距，對焦，光圈等，這些參數(shù)也會影響成像結(jié)果，您把它比作一臺數(shù)碼相機就很好理解了。下面我們分別了解一下這幾個參數(shù)。
1.CCD的幀率：理論上幀率越高，畫面越流暢，但也不是幀率越高越好，它還取決于顯示終端的顯卡配置，被測光源類型。百度百科搜索“幀率”您會看到以下內(nèi)容“大多數(shù)研究參與者認為調(diào)制光穩(wěn)定。這種調(diào)制光的穩(wěn)定感被稱為閃爍融合閾值。然而，當調(diào)制光是不均勻的并且包含圖像時，閃爍融合閾值可以高得多，數(shù)百赫茲”。如果我沒理解錯的話，調(diào)制光如果不均勻的話，閃爍融合閾值越高，圖像穩(wěn)定感越差。目前大多數(shù)葉綠素熒光成像系統(tǒng)的幀率為每秒30幀，屬于正常水平，也相當?shù)姆€(wěn)定可靠。另外一點，葉綠素熒光成像系統(tǒng)是一個”拍照“設備，不是一個“錄像”設備。無論您使用的是脈沖式還是調(diào)制式，我們都需要用到飽和閃光測量葉片的“瞬時”狀態(tài)并成像，輸出的也都是2D圖像，所以無需過分糾結(jié)幀率。
2.鏡頭焦距，對焦，光圈：這三個屬于鏡頭的常規(guī)參數(shù)，其實沒什么好說的，但是如果不注意的話還是會影響測量結(jié)果。A，焦距可以放大（拉近）/縮小（放遠）圖像，調(diào)整焦距并不會改變?nèi)~片與鏡頭和光源的距離。對測量不會產(chǎn)生本質(zhì)性的影響。B，對焦可以使圖像邊緣更加清晰，通常調(diào)整焦距后都需要重新對焦，否則圖像中的葉片邊緣可能是模糊的，輸出的熒光參數(shù)圖像里的葉片邊緣也是模糊的。C，光圈由通光孔葉片組控制的位于鏡頭中央的圓孔，光圈的大小決定了通過鏡頭到達檢測器的光線多少。這里值得一提的是光圈F/值越小，光圈孔徑越大，進入的光線越多，圖像越明亮。所以在測量過程中最好不要隨意更改光圈大小，特別是在用葉綠素熒光成像系統(tǒng)測量吸光度Absorptivity(Abs.)的時候，更是嚴禁調(diào)整光圈大小，如果不小心調(diào)了，需要重新調(diào)整Abs.測量所用光源的參數(shù)。如果之前沒在意光圈大小，做預實驗時發(fā)現(xiàn)測量光調(diào)到最低（Meas light Int.=1，Gain=1）AOI的Ft仍大于測量要求的上限值，此時需要先調(diào)整光圈，然后再到Settings設置測量參數(shù)。相反，如果測量光已經(jīng)調(diào)到很大，AOI的Ft仍不到測量要求的下限值，也需要先調(diào)整光圈，然后再到Settings設置測量參數(shù)。
M系列的MINI版的探頭是葉夾式的，可以直接夾住葉片測量即可，可以攜帶至野外使用。
M系列MICROSCOPY版是用于微藻或葉片顯微結(jié)構組織水平測量的系統(tǒng)。
3D版是套機，光源和鏡頭都固定在框架上，不可拆卸，3D版除了葉綠素熒光成像以外可以用于小型植株（擬南芥）3D成像，分析植株的表型，如葉片數(shù)量，葉面積等。
Mobile版是MINI版的變形，是專為雜草或貼地植物設計的版本，符合人體工學的背帶，延長的手柄大大提高了野外測量的便攜性，非常適合研究除草劑對雜草作用效果，在除草劑的研發(fā)和雜草管理上積累了大量的應用。
IMAGING-PAM不僅僅是數(shù)據(jù)圖像化那么簡單。
IMAGING-PAM葉綠素熒光成像系統(tǒng)發(fā)表的文章非常多，涉及的樣品類型五花八門，最常見的有擬南芥植株，單個葉片，藻液，藻斑，苔蘚，珊瑚，甚至還有愈傷組織。針對不同的樣品類型，測量時面臨的實際問題也千差萬別。比如，我們要求原位活體測量，盡量不要離體，但是有些植株體量比較大，無法整個放到成像區(qū)域，再比如有些樣品葉柄比較短，也同樣面臨類似的問題，還有測量藻液，如何才能避免液面的反光等等。當我們遇到上面這些問題時該如何解決，怎么樣才能保證測量是準確的？
具體情況需要具體分析，如果要展開講，一篇文章也不一定能講清楚，但我們還是根據(jù)經(jīng)驗還是總結(jié)了一些比較重要的注意事項，通過這篇文章分享給大家。澤泉科技作為WALZ的技術服務中心，對IMAGING-PAM特別熟悉，所以以它為例來講，如果您用的是其它品牌或型號的葉綠素熒光成像系統(tǒng)，也可以參考，畢竟原理是相通的。倘若下文內(nèi)容與您接受設備培訓聽到的測量理論有差別，歡迎各位讀者朋友留言咨詢，我們可以詳細交流，共同學習。
首先，我們可以看看IMAGING-PAM成像的圖片在文獻中是什么樣子的。然后再了解實際應用中有哪些使用要求，變形方式。下面的圖片展示了IMAGING-PAM測量擬南芥植株，擬南芥平板，大型植株，盛放藻類懸浮液的多孔板，巖石附著藻，苔蘚等出現(xiàn)在發(fā)表文章中的圖片。不難看出，IMAGING-PAM在不同類型的樣品中積累了大量的應用。
下面，我們以經(jīng)典的MAXI-IMAGING-PAM來看看在實際應用中根據(jù)不同樣品類型它有哪些變形方式。從下圖中不難看出，只需要簡單的更改組裝方式，即可實現(xiàn)封閉，半開放，開放式測量。離體葉片，盆栽，大型植株，盛放藻類的96孔板均可輕松搞定。
不同組裝方式可以讓系統(tǒng)變得靈活，適用多變的實驗需求，但是測量的本質(zhì)沒有變，還是葉綠素熒光。所以，一些測量的基本原則必須搞清楚，如工作距離，成像面積，測量區(qū)域光場的均勻性，光強（光化光+飽和脈沖）的強度等等，以上這些因素都會影響到您的實驗結(jié)果。
1. 測量區(qū)域光場的均勻性：MAXI版的IMAGING-PAM光源陣列的LED排布是經(jīng)過精心設計的，目的就是為了保證測量區(qū)域光場均一。經(jīng)測算，MAXI 版IMAGING-PAM的光場均一性在標準工作距離18.5 cm時最優(yōu)可達2%。MINI版本的IMAGING-PAM光源為四角相對排布，外圍尺寸9.4×8.6 cm，但是為了保證成像區(qū)域光場均勻，實際的成像面積則僅保留了2.4×3.2 cm的有效區(qū)域。測量區(qū)域光場的均勻性同樣是HEXAGON版本的旗艦參數(shù)。無論是MAXI版還是MINI版，再到現(xiàn)在最新的HEXAGON，德國WALZ始終堅守著該項技術的嚴謹性。
2.工作距離：為以MAXI版為例，工作距離根據(jù)組裝方式的不同可以實現(xiàn)14.5-22.5 cm可調(diào)。標準設置下，打開成像單元紅色的護眼罩，放入樣品架，然后在樣品架上放置葉片，葉片平展，此時葉片表面距離光源和鏡頭的距離即為標準工作距離18.5 cm。如果LED陣列和鏡頭脫離護眼罩，則可以很方便的調(diào)整工作距離。MINI版本的工作距離通常為固定的7 cm。HEXAGON版本的標準工作距離為20 cm。
3.成像面積：MAXI版工作距離為14.5 cm的時候，成像面積為7.5×10 cm；工作距離為22.5 cm的時候，成像面積是11×15 cm。MINI版工作距離為固定的7 cm，成像面積為2.4×3.2 cm。HEXAGON在標準工作距離下成像面積為20×24 cm。IMAGING-PAM的成像面積即為有效面積，有效面積內(nèi)的所有位置被無差別測量。
4. 光源光強，以MAXI版IMAGING-PAM目前搭載的LED光源陣列為例，需要300 W的額外供電。標準工作距離18.5 cm，光化光最大可達1900 μmol m-2 s-1PAR，大大超過所有植物的光飽和點。飽和脈沖最高可達4000 μmol m-2 s-1PAR，足夠關閉所有光系統(tǒng)的反應中心。HEXAGON-IMAGING-PAM的光源性能有了大幅的提升，標準工作距離20 cm，光化光最大可達3000 μmol m-2 s-1PAR，飽和脈沖最高可達5000 μmol m-2 s-1PAR，因此HEXAGON-IMAGING-PAM在工作距離上還有一定的調(diào)整空間。
IMAGING-PAM有非常多的應用，在我們整理的光合作用文獻數(shù)據(jù)庫中，是發(fā)表文章較多的型號，單個型號超過1800篇。2021年，IMAGING-PAM參與發(fā)表的相關論文曾兩次登上專業(yè)期刊的封面。德國WALZ掌握葉綠素熒光成像系統(tǒng)的核心技術。IMAGING-PAM，值得您的信任~
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