室溫下活體葉綠素?zé)晒饧肮庹T導(dǎo)的熒光變化由光系統(tǒng)II中激發(fā)的峰值在685 nm左右的葉綠素a熒光主導(dǎo)。光系統(tǒng)I熒光，F(xiàn)（I），峰值約730 nm，到目前為止被認(rèn)為在活體中是恒定的。在這里，我們提出證據(jù)表明在綠色單細(xì)胞藻類小球藻、藍(lán)藻聚球藻和淡綠色常春藤葉片中，F(xiàn)（I）對(duì)可變熒光有顯著貢獻(xiàn)。本研究用多激發(fā)波長(zhǎng)調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xMulti-Color-PAM測(cè)量了440 nm強(qiáng)光在小球藻稀懸液中誘導(dǎo)的多相熒光上升（O-I1-I2-P），檢測(cè)波長(zhǎng)分別在700 nm以上（F>700）和710 nm以下（F<710）。通過(guò)對(duì)F>700和F<710記錄的10條曲線取平均值，即使是很小的差異也能得到可靠的評(píng)估。對(duì)構(gòu)成特定F（II）響應(yīng)的O-I1相振幅進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，兩次記錄的O-I1-I2相接近相同，但F>700的I2-P相為F<710的1.42倍。用625 nm強(qiáng)光化光在暗狀態(tài)2下對(duì)聚球藻進(jìn)行的類似測(cè)量中，在O-I1標(biāo)準(zhǔn)化后，F(xiàn)>700的I2-P相甚至超過(guò)F<710的I2-P相1.99倍。在對(duì)小球藻的測(cè)量中，中等光化背景光和質(zhì)體醌拮抗劑DBMIB抑制了其I2-P相及PSI表觀可變熒光Fv（I）。對(duì)葉片的類似測(cè)量由于不可避免的光強(qiáng)梯度及由此產(chǎn)生的F>700和F<710的異質(zhì)來(lái)源而變得難以確定。但是一片淡綠色的常春藤幼葉定性地與懸浮液的結(jié)果相似，因此強(qiáng)烈地暗示葉片中也存在Fv（I）。
本研究是德國(guó)WALZ首席科學(xué)家，PAM熒光儀發(fā)明人，德國(guó)伍茲堡大學(xué)教授Ulrich Schreiber使用多激發(fā)波長(zhǎng)調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xMulti-Color-PAM做出的。該設(shè)備在具備極高靈敏度的同時(shí)又具有很高的時(shí)間分辨率，非常適合于研究不同光質(zhì)的強(qiáng)光誘導(dǎo)下葉綠素?zé)晒饪焖偌?xì)微的變化過(guò)程。文章發(fā)表在2021年1月的Photosynthesis Research上。
圖1 用于測(cè)量F>700（1 mm RG9+2 mm低熒光RG665）和F<710（短通710 nm+2 mm低熒光RG665）的探測(cè)器濾光片組的透射光譜
圖2 使用Multi-Color-PAM在F>700(紅色)和F<710(藍(lán)色)測(cè)得的小球藻多相熒光上升曲線的比較。440 nm脈沖調(diào)制測(cè)量光和440 nm光化光（4018 μmol m?2 s?1）。葉綠素含量200 μg L-1。每隔5分鐘交替測(cè)量10次F>700和F<710曲線的平均值。弱遠(yuǎn)紅光背景（1 μmol m?2 s?1 730 nm），用于誘導(dǎo)PS II供體和受體側(cè)狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)參考條件，并考慮長(zhǎng)期再現(xiàn)性。圖為PamWin-3軟件快速動(dòng)力學(xué)窗口的原始截圖。
圖3 對(duì)F>700響應(yīng)進(jìn)行重縮放后，F(xiàn)>700(紅色)和F<710(藍(lán)色)信號(hào)的比較，以給出與F<710響應(yīng)中相同的O-I1相位振幅。根據(jù)圖2所示的原始數(shù)據(jù)得出。使用4018 μmol m?2 s?1 440 nm。I1平臺(tái)在1 ms時(shí)到達(dá)(綠色垂直折線)。黑色垂直虛線放置在40 ms處，以標(biāo)記I2-P階段的開(kāi)始。使用Schreiber（1986）的原始命名法表示特征熒光水平O=Fo、I1、I2和P=Fm。a對(duì)數(shù)時(shí)間刻度。b線性時(shí)間刻度
圖4 標(biāo)準(zhǔn)化O-I1 Fv>700和Fv<710曲線的比較。通過(guò)減去各自Fo值從圖3中的數(shù)據(jù)導(dǎo)出
圖5 根據(jù)圖4所示的標(biāo)準(zhǔn)化O-I1 Fv>700和Fv<710曲線之間的差異得出的可變PS I熒光Fv（I）的動(dòng)力學(xué)。坐標(biāo)縮放如圖3所示。a組，線性時(shí)間刻度。b組，對(duì)數(shù)時(shí)間刻度
圖6 用96 μmol m?2 s?1 440 nm在恒定照光狀態(tài)下測(cè)量的多相熒光上升曲線導(dǎo)出的標(biāo)準(zhǔn)化O-I1 Fv>700和Fv<710曲線的比較。除背景照明外，使用相同的樣品進(jìn)行與圖4的實(shí)驗(yàn)相同的條件。F>700和F<710記錄各取10個(gè)平均值。比例與圖4相同。使用4018 μmol m?2 s?1 440 nm
圖7 在1 μM DBMIB存在下測(cè)量的多相熒光上升曲線得出的標(biāo)準(zhǔn)化O-I1 Fv>700和Fv<710曲線的比較。另外，與圖4的實(shí)驗(yàn)條件相同，用與圖4和圖6的測(cè)量樣品相同。在弱遠(yuǎn)紅光背景下，連續(xù)光照終止后2 h，在DBMIB存在下開(kāi)始測(cè)量?？s放比例與圖4和6相同。應(yīng)用4018 μmolm?2 s?1 440 nm
圖8 將標(biāo)準(zhǔn)化O-I1的F>700響應(yīng)(紅色)反褶積為小球藻中的F（I）(黑色)和F（II）(綠色)分量。在假設(shè)I2-P完全由Fv（I）引起的情況下，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化I2-P對(duì)F（I）進(jìn)行重標(biāo)度。F（II）(綠色)由標(biāo)準(zhǔn)化O-I1 F>700(紅色)減去標(biāo)準(zhǔn)化I2-P F（I）(黑色)得到。表明了Fo（I）和Fo（II）貢獻(xiàn)的振幅
圖9 根據(jù)在>700 nm和<710 nm處測(cè)量的強(qiáng)光照開(kāi)始時(shí)誘導(dǎo)的多相熒光上升曲線的平行記錄，在暗色素狀態(tài)2下，聚球藻中Fv（I）的定量。激發(fā)：脈沖調(diào)制440 nm ML。光化光：4229 m?2 s?1 625 nm加891 μmol m?2 s?1 440 nm（高頻脈沖調(diào)制ML）。每條曲線是4次記錄的平均值，每5分鐘交替測(cè)量一次F>700和F<710。a對(duì)F>700響應(yīng)重新縮放后的F>700(紅色)和F<710(藍(lán)色)信號(hào)進(jìn)行比較，得出與F<710響應(yīng)相同的O-I1相振幅。b O-I1平衡Fv>700和Fv<710反應(yīng)的比較。顯示了特征熒光水平。
圖10 將標(biāo)準(zhǔn)化O-I1的F>700響應(yīng)(紅色)反褶積為黑暗狀態(tài)2下的聚球藻的F（I）(黑色)和F（II）(綠色)分量。在假設(shè)I2-P完全由Fv（I）引起的情況下，對(duì)F（I）進(jìn)行重定標(biāo)。F（II）(綠色)由標(biāo)準(zhǔn)化O-I1的F>700(紅色)減去標(biāo)準(zhǔn)化I2-P的F（I）(黑色)得到。顯示了Fo（I）和Fo（II）貢獻(xiàn)的振幅
圖11 從淺綠色常春藤幼葉表面測(cè)量的F>700(紅色)和F<710(藍(lán)色)光誘導(dǎo)變化的比較。在1 ms下應(yīng)用單周轉(zhuǎn)飽和閃光以誘導(dǎo)QA最大還原。重新縮放F>700響應(yīng)，以獲得與F<710響應(yīng)相同的O-I1相位振幅。入射光強(qiáng)度：7800 μmol m?2 s?1 440 nm。a O-I1平衡可變熒光產(chǎn)額的比較。b初步反褶積F（I）(黑色)和F（II）(綠色)對(duì)整個(gè)Fv>700響應(yīng)(紅色)的貢獻(xiàn)，遵循與圖8和10中應(yīng)用的相同程序，分別為小球藻和聚球藻。
本研究結(jié)果為活體內(nèi)存在可變PS I熒光Fv（I）提供了有力證據(jù)，正如Lazar（2013）在生物信息學(xué)模擬基礎(chǔ)上提出的假設(shè)。這一證據(jù)是通過(guò)對(duì)綠藻和藍(lán)藻稀懸浮液中強(qiáng)光誘導(dǎo)的長(zhǎng)波和短波發(fā)射帶（F>700和F<710）熒光產(chǎn)額變化的相對(duì)簡(jiǎn)單的比較測(cè)量獲得的。F>700和F<710的多相上升動(dòng)力學(xué)的定量比較依賴于一個(gè)公認(rèn)的概念，即初始O-I1上升相反映了PS-II反應(yīng)中心的關(guān)閉，因此可以認(rèn)為是一種特殊的F（II）反應(yīng)。在標(biāo)準(zhǔn)化F>700和F<710響應(yīng)中O-I1相位的振幅后，兩個(gè)信號(hào)中的所有F（II）分量應(yīng)相等，而任何F（I）應(yīng)導(dǎo)致F>700大于F<710信號(hào)。這對(duì)Fo和Fv都是適用的。我們發(fā)現(xiàn)，不僅Fo>700大于Fo<710，而且Fv>700大于F<710。小球藻和聚球藻在I2水平上表現(xiàn)出相同的誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)，但在F>700時(shí)，隨后的I2-P相振幅明顯增大。這一發(fā)現(xiàn)得出了I2-P含有Fv（I）的結(jié)論，小球藻的光誘導(dǎo)變化如圖5所示。這些結(jié)果令人印象深刻地支持了Lazar（2013）關(guān)于Fv（I）預(yù)測(cè)振幅和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的生物信息學(xué)理論預(yù)測(cè)。因此，Dusan Lazar的模擬和我們的實(shí)驗(yàn)證據(jù)可以被認(rèn)為是互補(bǔ)的，相互支持的。
Dusan Lazar和我們的結(jié)論是基于一個(gè)普遍接受的假設(shè)，即綠色植物和藻類的熒光發(fā)射源于色素系統(tǒng)II或色素系統(tǒng)I，后者的發(fā)射在波長(zhǎng)>700 nm時(shí)更為明顯。當(dāng)這一假設(shè)被接受時(shí)，很難找到合理的替代理論來(lái)解釋歸一化O-I1的F>700曲線中I2-P相的相對(duì)差異，而非接近等于F<710曲線。然而，由于PSⅠ受體的耗盡（在Dusan-Lazar的模擬中誘導(dǎo)Fv（I））以及PSⅡ熒光的增加，不能完全排除這種可能性，應(yīng)該通過(guò)仔細(xì)的未來(lái)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究確證。PS-II熒光的這種增加不一定是由于PS-II反應(yīng)中心的光化學(xué)猝滅的抑制引起的，可能是由于某種形式的非光化學(xué)猝滅的抑制引起的，必須闡明其特性。推測(cè)這種猝滅的候選物可能是氧化的PQ（Vernotte等，1979年）或具有相對(duì)低效供體側(cè)的PS II的一部分，其中氧化的酪氨酸Z和P680+在強(qiáng)光下積聚（Steffen等，2005年）。
Chukhutsina等（2019年）采用了一種特殊方法，在完整的葉片上應(yīng)用了高度復(fù)雜的時(shí)間分辨熒光光譜法，“避免了影響熒光衰減痕跡的任何可能的光學(xué)人工干擾”，特別關(guān)注了PS I熒光的貢獻(xiàn)。但并未觀察到Fv（I）。在這種情況下，重要的是要認(rèn)識(shí)到Fv（I）是一種瞬態(tài)現(xiàn)象，它會(huì)被預(yù)照光抑制。在PSⅠ抑制劑存在下，最大PSⅠ熒光不能簡(jiǎn)單地由光照誘導(dǎo)，類似于在DCMU存在下Fm（II）的誘導(dǎo)。據(jù)我們所見(jiàn)，只有在使用可誘導(dǎo)重復(fù)顯示明顯I2-P相的樣品進(jìn)行測(cè)量的情況下，才有可能通過(guò)時(shí)間分辨熒光光譜法確認(rèn)活體內(nèi)Fv（I）的證據(jù)。在圖9和圖10的條件下對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行測(cè)量應(yīng)該不是一個(gè)太難的任務(wù)。
Schreiber教授在文章引言中表示，對(duì)于像他和Christof Klughammer這樣的儀器開(kāi)發(fā)者來(lái)說(shuō)，沒(méi)有什么比看到有能力的研究人員對(duì)我們的新設(shè)備進(jìn)行最佳利用更值得的了。有鑒于此，我們衷心感謝澳大利亞國(guó)立大學(xué)Fred Chow用PAM儀器進(jìn)行的所有精彩實(shí)驗(yàn)。我們將這篇關(guān)于PS-I在體內(nèi)的可變熒光的交流獻(xiàn)給他，希望我們的發(fā)現(xiàn)能幫助他發(fā)現(xiàn)更多復(fù)雜的光合作用拼圖中的小片段。也許現(xiàn)在一起尋找還不晚。